Einleitung
Bei dem Versuch „Flotation Assay“ und „Immunfluoreszenzmikroskopie“ geht es um zwei unterschiedliche Methoden, die sich in den Aussagen der Membranlokalisation des BMP Typ 1 Rezeptors ergänzen. BMPs (Bone Morphogenetic Proteins) sind Wachstumsfaktoren, die mehrere Differenzierungsprozesse regulieren, wie z.B. die Differenzierung der Knochenvorläuferzellen, durch diese sie ihren Namen tragen. Es gibt verschiedene Typ 1- und 2 Rezeptoren, die an den spezifische BMP-Liganden binden. Die Bindung führt zu einer Signalkaskade durch Phosphorylierung weiterer Liganden, die zur Aktivierung verschiedener Zielgene führt. Beide Versuche geben Auskunft über die Lokalisation des BMP Typ 1 Rezeptors in Lipid Raft haltiger Plasmamembran oder nicht-Lipid-Raft haltiger Plasmamembran. Es handelt sich um eine dichte Nanodomäne der Plasmamebran, aus Lipiden mit gesättigten Fettsäuren, die nur bestimmte Proteine aufnehmen und damit Prozesse wie Bindung und Spaltung zwischen Raft-lokalisierten Proteinen mit hoher Effizienz ablaufen. Ihre für die Versuche bedeutsame Eigenschaft ist, dass sie resistent gegenüber niedrigkonzentrierte Detergenzien sind und die Membran bis auf die Lipid Rafts bei Zugabe dieser lysiert wird. Lysieren der Plasmamembran führt mehreren Fraktionen in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten, den Zellfragmenten, Proteinen der Lipid-Rafts und dem Lipid-Protein-Gemisch, die Lipid Rafts. Dieses Gemisch weist eine geringere Dichte als die Proteine der nicht-Lipid-Rafts auf, und wird dementsprechend im niedrigkonzentrierten Bereich lokalisiert. Nach dem Fraktionieren der Proteine werden sie mittels SDS-Page ihrer Größe nach aufgetrennt und ein Western-Blot nach dem „Wet“ Verfahren einer Nitrocellulosemembran übertragen. Nach Primärantikörperinkubation mit mouse anti-HA und Sekundärinkubation mit goat anti-rabbit, wird der HA-Tag des Rezeptors und Flotillin2 durch Lumineszenz gemessen. Verwendet werden Mutanten, die sich in ihrer Transmembrandomäne des Typ 1 Rezeptors unterscheiden. Verschiedene Typen der BMPRs kommen unterschiedlich häufig vor, weshalb die Bandenintensitäten voneinander abweichen. Die Immunfluoreszenzmikroskopie basiert auf die Analyse der Kolokalisation des BMP-Rezeptors mit den Lipid Rafts. COS-7 Zellen werden mit verschiedenen ALK6-Konstrukturen mithilfe von PEI transfiziert, die die DNA positivieren und der PEI/DNA-Komplex durch die ionische Wechselwirkung mit der negativ geladenen Zellhülle in die Zelle aufgenommen wird. Die Zelle wird permeabilisiert, sodass verschiedene Zellbestandteile zugänglich sind und mit Farbstoffen angefärbt werden. Dabei wird das Aktin im Zytokelett mit Phalloidin und die DNA mit DAPI angefärbt, die bei Bestrahlung mit Licht unterschiedliche Fluoreszenz aufweisen und unter dem Mikroskop unterschieden werden können. Um Flotillin und den BMP-Rezeptor lokalisieren zu können werden außerdem fluoreszierende Sekundär-Antikörper verwendet.
